题材
《最后的晚餐》壁画取材自基督教圣经马太福音第26章，描绘耶稣在遭罗马士兵逮捕的前夕和十二宗徒共进最后一餐时预言“你们其中一人将出卖我”后，门徒们显得困惑、哀伤与骚动，纷纷询问耶稣：“主啊，是我吗？”的瞬间情景。唯有坐在耶稣右侧（即画面正方左边第五位）的叛徒犹达斯（基督新教中文作犹大）惊慌地将身体往后倾，一手抓着出卖耶稣的酬劳——一个装有三十块银币的钱袋，脸部显得阴暗。
据说达芬奇在绘作此图时，所有人面孔皆已设想好，惟有加略人犹大未想好。当教堂神父来催达芬奇时，与其谈到此问题，恰好该神父对其主教有点微词，听闻达芬奇欲用主教之脸当作犹大的脸孔，连声同意，并开怀大笑。
耶稣说：“凡洗过澡的人，只要把脚一洗，全身就干净了。你们是干净的，然而不都是干净的。”
一共13个人，只有7个人胸前有宝石配饰。 众门徒两两同名，一个如光，一个像影。 耶稣在十字架上，有两个强盗一左一右，在他两边，一个悔改了，所以被释放了。另一个没有。 山羊和绵羊何其相像，石头和鸡蛋也很相似，餐桌之上谁能分辨？ 摩西曾让12支派分两队，分别站在基列心山和以巴路山，分别对着彼此，一个说祝福的话，一个说咒诅的话。
画作内容
高4.6米，宽8.8米，画面利用透视原理，使观众感觉房间随画面作了自然延伸。为了构图使徒坐得比正常就餐的距离更近，并且分成四组，在耶稣周围形成波浪状的层次。越靠近耶稣的门徒越显得激动。耶稣坐在正中间，他摊开双手镇定自若，和周围紧张的十二门徒形成鲜明的对比。耶稣背后的门外是祥和的外景，明亮的天空在他头上仿佛一道光环。他的双眼注视画外，仿佛看穿了世间的一切炎凉。最后的晚餐的画中窗外显示是白天，因此被人列为疑点。
